Pewarnaan sederhana-masariff

I.                   JUDUL PRAKTIKUM

Pewarnaan Sederhana

II.                TUJUAN

1.      Mengetahui cara kerja dan prinsip pewarnaan positif dan pewarnaan negatif

2.      Mengetahui morfologi dan struktur sel bakteri dengan mewarnai sel bakteri

III.             DASAR TEORI

Apabila kita ingin mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bekteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup maupun dalam keadaan mati. Pemerikasaan morfologi ini perlu untuk mengenal nama bakteri dan sifat-sifat fisiologi yang merupakan faktor penentu dalam mengenal nama spesiesnya.

            Pada rangkaian pengamatan bakteri, terdapat cara untuk mengetahui sifat-sifat morfologi tersebut yaitu dengan pewarnaan bakteri. Larutan pewarna tidak dapat langsung masuk ke dalam sel hidup. Oleh karena itu, sel biasanya di bunuh dahulu sebelum dilakukan pewarnaan. Sel yang mati akan menyerap dan mempertahankan pewarna. Cara umum untuk membunuh sel adalah dengan fiksasi panas. Sel diapuskan pada gelas objek sehingga diperoleh lapisan tipis. Preparat kemudian dipanaskan pelahan-lahan untuk membunuh sel. Metode pewarnaan bakteri ditemukan oleh ilmuwan asal Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteriterhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan padamikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif berwarna ungu (Levine, 2000).

Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003).

Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan –pewarnaan sederhan Karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhan umumny bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelutur warna, substrat, intensifikasi, pewarnaan dan penggunaan warna penuttup. Suatu preparat yang sudah menyerap zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri ini di sebut bakteri tahan asam, dan ini merupakan ciri khas bagi suatu spesies (dwidjoseputro, 1994).

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zatwarna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar &Chan, 1986).

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :

1.       Pewarnaan Sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi (coccus, basil, vibrio, spiral) dan susunan selnya (rantai, bergerombol, berpasangan, tetrad) Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin.

Ø  Pewarnaan negatif

Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti Spirochaeta.

Ø  Pewarnaan positif

Sebelum dilakukan pewarnaan positif hendaknya membuat ulasan diatas objek glass, kemudian difiksasi. Ulasan jangan terlalu tebal karena akan mempersulit mencari bakteri dalam pengamatan dengan mikroskop.

2.       Pewarnaan Diferensial

Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam (acid fast). Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur.

Ø  Pewarnaan gram

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.

Ø  Pewarnaan acid fast

Pewarnaan ini digunakan untuk membedakan bakteri yang tahan terhadap larutan asam dan yang tidak tahan terhadap larutan asam. Reagen yang digunakan dalam pewarnaan acid fast terdiri dari cat utama, peluntur alkohol asam, dan cat lawan / tanding.

3.       Pewarnaan khusus

Untuk mewarnai struktur khusus dari bakteri seperti kapsul, spora, flagel dll.

Ø  Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel.

Ø  Pewarnaan spora

Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis. 

Pada praktikum kali ini, akan dilakukan pewarnaan positif (basa) menggunakan zat warna methylen blue, crystal violet, dan safranin dan pewarnaan negatif (asam) menggunakan tinta cina atau nigrosin.

IV.             ALAT DAN BAHAN

ALAT :

·         Objek glass

·         Jarum inokulum / ose

·         Pembakar spirtus

·         Mikroskop binokular

·         Tabung reaksi

·         Pipet tetes

·         Rak tabung reaksi

           

BAHAN :

·         Biakan bakteri (Bacillus, Tetracoccus, Providencia, Staphyllococcus)

·         Aquadest

·         Spirtus

·         Pewarna methylen blue, safranin, kristal violet

·         Kapas

·         Xylol

·         Minyak imersi

·         Tinta cina

V.                 CARA KERJA

A. Pewarnaan Positif

1.      Bersihkan obyek glass dengan kapas

2.      Jika perlu tulislah kode nama bakteri pada sudu objek glass

3.      Panaskan ose diatas api hingga membara

4.      Putar kapas penutup tabung aquadest sebelum membuka tabung reaksi dan kemudian tarik kapas peenutup tabung reaksi yang berisi aquadest. Setelah di buka, panaskan mulut tabung reaksi dengan api

5.      Ambilah aquadest dengan menggunakan ose yang telah di sterilisasi dengan api, kemudian oleskan ke tengah - tengah objek glass, lakukan 2-3 kali

6.      Sebelum menutup tabung reaksi panaskan kembali mulut tabung reaksi.

7.      Ambilah bakteri yang telah di kultur di dalam tabung  reaksi dengan cara putar kapas penutup tabung kultur bakteri sebelum membuka tabung reaksi, dan kemudian tarik kapas penutup tabung reaksi yang berisi kultur bakteri. Setelah di buka, panaskan mulut tabung  reaksi dengan api. Masukan ose yang telah di stirilisasi untuk mengambil bakteri dengan cara mengoleskan ke permukaan kultur bakteri sebanyak 1-2 ose kemudian oleskan pada objek glass, tepat diatas permukaan aquadest yang telah diteteskan sebelumnya pada objek glass yang sama, putar dan ratakan bakteri dengan air hingga sedemikian rupa membentuk lingkaran kurang lebih berdiameter 1 - 2 cm

8.      Fiksasi perparat yang telah diolesi bakteri tersebut di atas api sampai kering (preparat smear).

9.      Setelah benar – benar kering, genangilah objek glass yang berisi ulasan bakteri tersebut dengan cat pewarna ( methylen blue, safranin, crystal violet ) selama kurang lebih 30 detik

10.  Setelah 60 detik cucilah denggan air mengalir dan keringkanlah kembali ulasan yang masih basah di atas api.

11.  Amatilah ulasan dibawah mikroskop dengan  perbesaran  lemah, setelah fokus teteskan  minyak emersi tepat diatas preparat dan ganti lensa obyektif dengan perbesaran kuat 100x.

Gambar 1. Skema pewarnaan positif

B. Pewarnaan Negatif

1.      Sediaakan objek glass sebanyak 2 buah, bersihkan objek glass dengan spirtus atau alkohol supaya objek glass yang akan kita pakai terbebas dari lemak.

2.      Teteskan nigrosin ( tinta cina ) pada ujung kanan dari salah satu objek glass.

3.      Ambil ose dan kemudian sterilisasi ose tersebut dengan cara memanaskan ujung ose di api spirtus sampai membara.

4.      Ambilah tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, putar terlebih dahulu sebelum menarik penutupnya, panaskan mulut dari tabung reaksi sebelum mengambil bakteri dengan ose, setelah dipanaskan ambil kultur bakteri dengan ose. Sebelum menutup panaskan kembali mulut dari tabung kultur.

5.      Oleskan kultur dari bakteri yang telah kita ambil dengan ose tepat pada tinta cina yang kita teteskan di ujug kanan objek glass.

6.      Tempelkan sisi objek glass yang lain tepat pada tinta cina dengan posisi objek glass membentuk sudut 45^o.

7.      Geser objek glass yang kita tempelkan di atas tinta cina tersebut ke arah kiri, pastikan bahwa ada bagian yang cukup tipis dari olesan tinta tersebut agar dapat diamati dengan mudah.

8.      Keringkan tinta cina tersebut diatas api sehingga cepat mengering.

9.      Setelah kering lakukan pengamatan dengan mikroskop menggunakan perbesaran lemah, setelah fokus teteskan  minyak emersi tepat diatas preparat dan ganti lensa obyektif dengan perbesaran kuat 100x.

Gambar 2. Skema pewarnaan negatif

VI.      HASIL PENGAMATAN

1)     Pewarnaan Positif

Gambar	Keterangan
	·         Nama Bakteri : Bacillus sp ·         Bentuk : Batang (basil) ·         Susunan : berderat ·         Warna : ungu ·         Zat warna : chrystal violet
	·         Nama Bakteri : Staphylococcus sp ·         Bentuk : Bulat ·         Susunan : Bergerombol ·         Warna : Biru ·         Zat warna : Methylen blue
	·         Nama Bakteri : Providencia ·         Bentuk : Bulat memisah, batang, kecil-kecil. ·         Susunan : menyebar satu-satu ·         Warna : merah ·         Zat warna : Safranin

2)      Pewarnaan negatif

Gambar	Keterangan
	·         Nama Bakteri : Tetracoccus
	·         Nama Bakteri : Bacillus sp

VII.     PEMBAHASAN

            Sel bakteri dapat diamati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Berikut hasil percobaan mengenai pewarnaan bakteri yang telah dilakukan yaitu pewarnaan sederhana dam pewarnaan negatif.

1.      Pewarnaan Sederhana (positif)

Pada pewarnaan sederhana, apusan bakteri diwarnai dengan reagen tunggal(satu jenis zat warna) yang dihasilkankontras antara organisme dan latar belakangnya. Pada pewarnaan ini dipilih pewarnaan basa (basic stains) yang mengandung kromogen positif, karena asam nukleat dan komponen tertentu pada dinding sel bakteri membawa muatan negatif yang akan berikatan dengan kuat terhadap kromogen kationik.

Sebelum melakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri diatas object glas kemudian difiksasi. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya. Bakteri akan terlihat berwarna sesuai dengan pewarna yang digunakan. Misalnya berwarna merah dengan safranin atau ungu dengan crystal violet atau biru dengan methylen blue.

Pada praktikum ini didapati hasil hasil bahwa pada permukaan bakteri Bacillus Sp dengan pengamatan mikrokop pada perbesaran 100x10 bentuk bakterinya basil atau batang dan susunanya berderet lalu warna yang tetap menempel adalah warna ungu karena pewarna yang digunakan adalah crystal violet, sehingga diketahui bahwa Bacillus Sp merupakan gram positif. Pada bakteri Staphylococcus dengan pengamatan mikroskop 100x10, bentuk bakterinya adalah bentuk bulat berantai dengan warna yang tetap menempel adalah warna biru atau methylene blue, sehingga pada bakteri Staphylococcus ini termasuk dalam gram positif. Seperti yang telah kita ketahui bahwa bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses  sehingga akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop.

Sedangkan pada bakteri Providencia dengan pengamatan mikroskop pada pembesaran 100x10 bentuk bakterinya yaitu bulat memisah dan batang kecil-kecil dengan susunan bakteri yang menyebar satu-satu, warna yang tetap menempel pada bakteri tersebut berwarna merah karena menggunakan pewarna safranin. Sehingga pada bakteri ini diketahui termasuk dalam gram negative karena Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop.

2.      Pewarnaan Negatif

Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan pewarna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarna negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel tetapi mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam. Pewarnaan negatif membutuhkan pewarnaa asam (acidic stain). Pewarnaan negatif atau pewarnaan asam mengandung kromosom yang bermuatan negatif, sehingga tidak akan berpenetrasi kedalam sel karena permukaan bakteri bermuatan negatif. Oleh karena itu sel yang tak terwarnai akan jelas terlihat pada latar belakang yang telah terwarnai. Contoh zat warna yang sering digunakan adalah tinta cina atau nigrosin.

Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa pada pewarnaan negatif diketeahui bentuk luar dan karakteristik dari bakteri yang sulit diwarnai, sehingga hanya mewarnai latar belakangnya saja. Bakteri yang digunakan adalah Bacillus sp dan Tetracoccus. Bacillus sp yang merupakan bakteri basil dengan ukuran 0,5 micro x 0,1 micro dan bentuk dari bakteri tersebut adalah batang.. Biasanya bakteri tersebut ditemukan berkoloni atau membentuk endosporan oval atau silinder. Pada bakteri Tetracoccus ditemukan bakteri berbentuk coccus (bulat) rata-rata bergandengan empat dan membentuk bujur sangkar. Bagian tubuh bakteri yang tidak terwarnai (transparan) tetapi latar belakangnya hitam karena tidak menyerap zat warna yang diberikan yaitu tinta cina.

VIII.       KESIMPULAN

Pewarnaan positif adalah pewarnaan pada bakteri menggunakan zat warna tunggal basa seperti methylen blue, safranin, dan crystal violet. Pada praktikum pewarnaan ini dapat ditarik kesimpulan bahwa bakteri Bacillus Sp dengan pengamatan mikroskop bentuk bakterinya basil atau batang dengan warna yang menempel adalah ungu, sehingga diketahui bakteri ini termasuk dalam pewarnaan gram positif. Pada bakteri Staphylococcus dengan pengamatan mikroskop bentuk bakterinya adalah bentuk bulat berantai dengan warna yang menempel adalah biru dan bakteri ini termasuk kedalam pewarnaan positif. Sedangkan pada bakteri Providencia dengan pengamatan dibawah mikroskop bentuk bakterinya adalah bulat memisah dan batang kecil-kecil dengan warna yang menempel pada bakteri ini yaitu warna merah atau safranin, sehingga bakteri ini diketahui termasuk kedalam pewarnaan gram-negatif.

Dari pewarnaan negatif setelah diamati dibawah mikroskop terlihat bentuk bakteri Bacillus dan Tetracoccus yang transparan dengan latar belakang yang hitam berasal dari cairan nigrosin. Karena prinsipnya pewarnaan negatif tidak mewarnai bakteri tetapi mewarnai lingkungan sekitarnya.

IX.             DAFTAR PUSTAKA

Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht ,. (diunduh pada tanggal 5 Maret 2016 pukul 20:29)

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta

Pelezar,chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta

Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba.http://wordbiology.wordpress.com

(diunduh pada tanggal 5 Maret 2016 pukul 21:04)

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.

Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM. Malang

Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali